Western blot(웨스턴블롯) 이해하기

 

웨스턴 블롯(Western blot, Western blotting)은 세포 또는 조직으로부터 추출된 단백질 혼합물에서 특정 단백질을 검출하는 것입니다. 웨스턴 블롯의 3가지 주요 단계는 크기별로 분리, 안정적인 support로 transfer, 적절한 1차 및 2차 항체를 사용한 시각화입니다.

 

Western Blot(웨스턴 블롯) 단계 별 프로세스

 

1) 겔 전기영동 (Gel electrophoresis)

​샘플 내 단백질은 겔 전기영동을 사용하여 분리됩니다. 단백질은 분자량 및 전하 등의 요소에 따라 분리될 수 있는데, 이는 샘플 처리 방식과 겔의 특성에 따라 달라집니다. 

일반적으로 사용되는 겔 전기영동은 폴리아크릴아미드 겔과 sodium dodecyl sulfate(SDS)가 로딩된 버퍼를 포함합니다. 이 겔 전기영동은 SDS-PAGE라고 일컫는데, 강 환원제를 통해 폴리펩티드의 이차 삼차 구조를 제거합니다. 샘플 단백질은 음의 전하를 띄게 되어 양의 전하를 띤 anode를 향해 이동하며, 더 작은 단백질일수록 빨리 이동하게 됩니다. 이렇게 SDS-PAGE는 크기에 따라 단백질을 분리합니다. 

 

 

2) Transfer

​항체를 사용하여 단백질을 검출하기 위해서는 단백질을 겔에서 nitrocellulose(NC) 또는 PVDF 멤브레인으로 transfer 해야 합니다. 단백질을 transfer 하는데 일반적으로 사용되는 방법은 일렉트로블로팅(electroblotting)입니다. 일렉트로블로팅은 전류를 사용하여 겔에서 음전하의 단백질을 빼내 PVDF나 NC 멤브레인으로 옮깁니다. 

 

 

3) Probing & Imaging

멤브레인과 타겟 단백질의 검출을 위해 사용되는 항체 간 결합을 막기 위해, 멤브레인을 skim milk나 bovine serum albumin(BSA)으로 처리하여 blocking을 수행합니다. Blocking 반응 후, 타겟 단백질을 검출할 수 있게 설계된 항체를 넣습니다. 항체가 타겟 단백질에 결합하는 특성을 통해 타겟 단백질을 검출할 수 있습니다. 비특이적 결합을 최소화하기 위해 wash 과정이 진행되며, 그 후에 Western blot을 통해 타겟 단백질에 결합한 항체를 검출할 수 있습니다. 

 

Western blotting은 일반적으로 최소 5시간에서 최대 2일까지 걸릴 수 있습니다. 아반토의 VWR Life Science AMRESCO는 웨스턴 블롯의 각 단계를 빨리 진행할 수 있도록 지원하는 시약들을 개발하였으며, 이를 사용하면 전체 Western blotting을 1시간 30분 이내로 완료할 수 있습니다. 

 

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