크로마토그래피(Chromatography)는 분자 구조 및 성질에 따라 혼합물의 물질을 분리하는 기법입니다. 크로마토그래피를 통한 분리는 고정상(stationary phase)과 이동상(mobile phase)을 이용하는데, 이동상(mobile phase)은 크로마토그래피 컬럼(Chromatography column) 내 고정상을 통과해서 흐르며 이때 다른 두 성질의 물질을 분리합니다. 여러 종류의 크로마토그래피 분리 기법이 있는데, 이는 분리하고자 하는 샘플의 특성에 따라 달라집니다. 이번 포스팅에서는 대표적인 크로마토그래피 분리 기법에 대해 알아보겠습니다.

크로마토그래피 분리 기법

분리하고자 하는 샘플의 크기에 따라 적용하는 크로마토그래피 기법이 달라질 수 있으며, 분자량 5,000을 기준으로 사용할 수 있는 크로마토그래피 기법은 아래와 같습니다.

Normal Phase Chromatography
순상 크로마토그래피(Normal phase chromatography)에서 이동상은 non polar이고, 고정상은 polar입니다. 물질의 극성 차이를 통해 샘플을 분리하며, 가장 전통적인 크로마토그래피 기법의 하나입니다. 일반적으로 크로마토그래피 칼럼은 극성인 실리카로 채워져 있기 때문에 분자가 극성일 경우 실리카 칼럼에 결합하고, 비극성 분자는 고정상을 빠르게 통과할 것입니다. 

Reverse Phase Chromatography

역상 크로마토그래피(Reverse phase chromatography)에서 이동상은 polar이고 고정상은 non polar입니다. 가장 널리 사용되는 기법이며, 컬럼 내 실리카는 8 또는 18개의 탄소를 추가함으로써 비극성 처리가 되었습니다. 분자가 비극성일 경우 실리카 칼럼에 결합하고, 극성 분자는 고정상을 빠르게 통과할 것입니다. oxidation 또는 deamidation과 같은 변형을 거친 단백질 분석에 활용됩니다.

Ion Exchange Chromatography

이온 교환 크로마토그래피(Ion exchange chromatography)는 ionic compound의 분리와 측정을 위해 사용되는 중요한 분석 기술입니다. 이온 크로마토그래피 분리는 이온 및 극성 분석물, 용리액에 존재하는 이온 및 크로마토그래피 지지체에 고정된 이온 작용기간의 이온 상호 작용을 기반으로 합니다. 경쟁 이온 결합 (attraction)으로 인한 이온 교환 및 유사한 전하를 가진 분석물 이온과 크로마토그래피 지지체에 고정된 이온 사이의 반발로 인한 이온 배제는 이온 크로마토그래피 분리에 중요한 역할을 합니다. 이 기법은 분자 크기와 분자 특성이 다른 전하 분자인 펩타이드, 단백질, 핵산 및 생체 고분자 분리에 사용되는 중요한 기술 중 하나입니다.

Size Exclusion Chromatography

사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)는 분자를 크기에 따라 분리하는 기법으로, 겔은 특정 크기의 기공을 포함하는 구형 비드로 구성됩니다. 크기가 다른 분자가 매트릭스 내 기공에 포함되거나 제외될 때 분리가 발생하게 됩니다. 작은 분자는 기공으로 확산되어 컬럼을 통한 작은 분자의 흐름이 지연되는 반면, 큰 분자는 기공으로 들어가지 않고 컬럼의 허공용적에서 용출됩니다. 결과적으로 분자는 컬럼을 통과할 때 크기에 따라 분리되고 분자량이 큰 순서로 용출됩니다. 해당 기법은 주로 단백질 aggregation과 degradation을 확인하기 위해 사용됩니다.

Hydrophilic Interaction Chromatography

Hydrophilic interaction chromatography(HILIC)는 친수성 고정상과 친수성 수성 극성 유기 이동상에서의 머무름(retention)을 기준으로 높은 친수성 및 극성 화합물을 분리하는 데 사용되는 액체 크로마토그래피 기법입니다. HILIC에서는 가장 친수성이 높은 물질이 빨리 용출된다는점입니다. 이는 일반적인 역상 크로마토그래피에서 볼 수 있는 순서와 대조적입니다. HILIC는 역상 LC에서 머무름이 적은 친수성 화합물을 효과적으로 머무르게 하여, 머무름(retention)이 없어 분석하기 힘든 샘플에 적용됩니다.

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폐기할지 혹은 재활용할지 결정하기 위해 실험실 테스트를 통해 폐수의 품질을 측정하는 것이 중요합니다. 폐수의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성을 확인하기 위해 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이러한 분석 테스트는 더욱 민감해지고 있으며, 모든 산업에서 실험 결과를 검증하고 추적 가능한지 확인해야 할 필요성이 커지고 있습니다.

물리적 특성

온도

​수생 생물은 특정 온도 범위 밖에서는 생존할 수 없습니다. 관개 유출수 및 발전소의 수냉각법은 일부 수생 생물의 생존 온도 범위 이상으로 온도를 상승시킬 수 있습니다. 온도 상승은 또한 산소 농도를 감소시키는 조류 번식을 일으킬 수 있습니다.

고체 물질

폐수에 있는 고체 물질은 용해, 부유 또는 침전될 수 있습니다. 용존고형물총량(total dissolved solids, TDS)은 측정된 부피의 여과수를 증발시킬 때 남은 잔류물의 질량으로 정의됩니다. 필터에 남아있는 건조 고형물의 질량을 부유고형물총량 (total suspended solids, TSS) 또는 여과 불가능한 잔류물이라고 합니다. 침전된 고체물은 물이 1시간 동안 침전된 후 임호프 콘 바닥에 축적된 가시적 부피로 측정됩니다. 

탁도는 물에 있는 부유 물질의 빛 산란능력을 측정한 것입니다. 염도는 용해된 물질로 인한 물의 밀도 또는 전도도 변화를 측정합니다. 

화학적 특성

​다양한 화학 물질이 물에서 발견될 수 있지만 그 중 중요한 화학 원소는 소수에 불과합니다. 비소, 카드뮴, 납 및 수은과 같은 금속은 자연적으로 발생하는 화합물입니다. 이러한 금속은 토양, 물 및 대기와 같은 환경에서 다양한 농도로 존재할 수 있습니다. 농업, 산업 또는 자동차 배기 가스와 같은 인간 활동 또는 식품 가공 및 보관 중 오염으로 인해 이러한 금속은 식품의 잔류물로 발견될 수 있습니다. 사람들은 환경에서 또는 오염된 음식이나 물을 섭취하여 이러한 금속에 노출될 수 있습니다. 금속이 신체에 축적되면 시간이 지남에 따라 해로운 영향이 나타날 수 있습니다. 금속의 분석을 위해 ICP-MS 및 ICP-OES와 같은 기술이 필요합니다. 올바른 분석 결과를 위해서는 기기 교정이 중요합니다.

원소의 wet chemistry에 관한 지식은 샘플 및 화학 표준물질을 준비하는데 있어 원소간 침전, 개별 원소 가수분해, 매트릭스 효과, 간섭 오염등과 같은 문제를 방지하는데 필수적입니다.

수소

다양한 물은 하이드로늄(hydronimum) 양이온과 히드록실기(hydroxyl) 음이온으로 이온화됩니다. 이온화된 수소의 농도는 pH로 표시됩니다. 

pH 측정은 환경 실험실에서 사용하는 가장 일반적인 실험방법중 하나입니다. pH 측정기를 교정하기위해서는 버퍼 표준물질이 중요한 역할을 합니다.

산소

대부분의 물고기나 기타 수생 동물들은 생존을 위해 최소 용존 산소가 필요합니다. 환경 화학에서는 화학적 산소 요구량(chemical oxygen demand, COD)과 생화학적 산소 요구량(biochemical oxygen demand, BOD) 두 가지 방법이 사용됩니다. BOD 및 COD 테스트는 폐기 오염물질의 상대적인 산소 고갈 효과를 측정합니다. 두 가지 테스트 모두 오염 측정의 척도로 널리 사용되고 있습니다. 

BOD 테스트는 생분해성 오염물질의 산소 요구량을 측정하는 반면, COD 테스트는 생분해성 오염물질의 산소요구량과 비생분해성 산화성 오염물질의 산소 요구량을 측정합니다.

COD는 측정된 용액에서 반응에 사용될 수 있는 산소의 양을 나타내는 지표입니다. 일반적으로 용액의 부피에서 소비되는 산소 질량으로 표현되며, SI 단위는 리터당 밀리그램(mg/l)입니다. COD 테스트는 물에 있는 유기물의 양을 정량화하는데 사용할 수 있습니다. COD는 폐수가 수역에 미치는 영향을 보여주는 지표로써, 수질 측정에 유용합니다.

BOD는 박테리아와 같은 미생물이 유기 오염물 (당, 지방, 단백질)을 소비하는데 필요한 산소의 양(mg/l)을 의미합니다. 모든 오염이 박테리아에 의해 제거될 수 있는 것은 아닙니다. 오염된 물의 BOD 수치는 일반적으로 담수의 BOD 수치보다 높습니다. 가정 하수, 석유 잔류물 및 동물과 작물 폐기물로 인해 BOD가 증가할 수 있습니다.

COD 테스트는 2~3시간이 소요되는 반면, BOD는 5일이 소요됩니다.

* 해당 글의 전문은 첨부파일에서 확인하실 수 있습니다.

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페놀 화합물은 방향족 탄화수소 고리에 부착된 수산기(hydroxyl group)를 포함합니다. 이러한 화합물은 살충제, 퍼스널 케어 제품, 소독제 및 목재 방부제에서 발견될뿐만 아니라 산업 제조 공정에서 사용되는 등 여러 경로를 통해 환경에 유출될 수 있기 때문에 환경 모니터링에서 관심있게 지켜봐야 할 물질입니다.

페놀 화합물은 일반적으로 미량으로 존재하기 때문에 황산염과 글루코나이드 접합체로 빠르게 대사되고 소변으로 체내에서 제거됩니다. 따라서 인체에 해롭지 않습니다. 하지만 작업 환경에서 높은 농도의 특정 페놀 화합물에 장기간 노출되면 신경계와 간에 악영향을 미칠 수 있습니다. 일부 페놀 화합물(예: 클로로페놀)은 환경에 축적되어 수생 생물에 유독합니다. 이러한 이유로 페놀 화합물의 환경 방출을 통제하기 위해 European Directives가 제정되었습니다. 액체 크로마토그래피(LC)는 환경에서 미량의 오염물질을 측정하고 정량화하는 효과적인 기술입니다. 이번 블로그에서는 환경에서 여러 종류의 페놀 화합물을 모니터링하는데 사용할 수 있는 새로운 ACE reversed-phase chemistry가 적용되는 분야를 설명합니다. 

먼저, 아래 Figure 1의 UV 검출은 새로운 ACE C18-PFP 상을 이용한 14개의 페놀 및 페녹시산 기반 제초제의 분리를 보여줍니다. 이러한 화합물 중 일부는 수생 생물에 유해한 클로로페놀이며 인체 건강에 해를 끼칠 가능성이 있습니다. C18-PFP 상의 방향족 선택성은 밀접하게 관련된 고리형 분석물의 성공적인 분리를 가능하게합니다. 포름산을 이동상 첨가제로 사용하여 gradient method를 수행하여 20분 이내로 해당 분석물을 분리할 수 있었습니다. 

Figure 2의 UV 검출은 새로운 ACE C18-Amide 상을 사용하여 지하 침출수에서 발견되는 13개의 페놀 화합물을 분리한 LC-UV 방법을 보여줍니다. 분석물에는 살충제, 제약 화합물, 향료의 제조를 위해 여러 산업 공정에서 전구체로 사용되는 메틸페놀 및 벤젠디올의 다양한 positional isomer가 포함됩니다. 포름산을 함유하는 isocratic 이동상을 사용하여 25분 이내로 이러한 분석물을 분리하였습니다. 

Bisphenol A (BPA)는 플라스틱 제조업체에서 사용되는 페놀 화합물의 일종입니다. 이는 에스트로겐 신호 경로를 방해할 수 있는 내분비 교란 물질로 알려져있습니다. 해당 물질은 물병과 식품 포장과 같은 물질에서 흡수될 때 인간의 생식/발달에 영향을 미칠 수 있는 물질로 제시되었습니다. 

많은 양의 BPA가 플라스틱 제품 및 폐수 처리 공장에서 침출되어 환경으로 방출되고 있습니다. BPA의 잠재적인 인체 유해성으로 인해 환경 샘플의 정량 분석을 수행하는 것이 중요해지고 있습니다.

일반적으로 사용되는 또 다른 페놀 화합물은 비누, 세재 및 기타 퍼스널 케어 제품에 사용되는 미생물 제제인 트라이클로산(triclosan)입니다. 해당 물질은 인체 안정성의 이유로 많은 연구가 이뤄지고 있습니다. 트라이클로산은 폐수 처리장에서 다량으로 환경에 방출될 수 있으며 수생 생물에 유독할 수 있습니다. 따라서 환경 샘플에서 발견되는 트라이클로산 농도를 모니터링하는 것이 중요합니다.

Figure 3은 환경 샘플에서 일반적으로 발견되는 페놀 화합물의 검출을 위한 민감한 LC-MS/MS 방법을 보여줍니다. BPA 및 트라이클로산을 포함한 13개의 페놀 분석물을 분리하기 위해 새로운 ACE C18-PFP상에서 60~100% 메탄올 gradient 방법을 적용하였습니다. 이 방법은 원래 사람의 소변에서 페놀 화합물의 농도를 측정하기 위해 개발되었습니다.

앞서 설명한 바와 같이, 페놀 화합물은 여러 공급원으로부터 환경으로 방출될 수 있으며 수생 생물과 인간에게 유독할 수 있습니다. 따라서 이러한 화합물의 농도를 모니터링하여 안전한 농도로 존재하는지 확인하는 것이 필수적입니다.

이번 블로그에서는 세 가지 다양한 페놀 화합물의 분리 및 검출 방법을 제시하였습니다. 마지막 MS/MS 방법은 인간 소변 샘플에서 미량의 페놀 화합물 분석에 사용될 수도 있습니다.

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