크로마토그래피(Chromatography)는 분자 구조 및 성질에 따라 혼합물의 물질을 분리하는 기법입니다. 크로마토그래피를 통한 분리는 고정상(stationary phase)과 이동상(mobile phase)을 이용하는데, 이동상(mobile phase)은 크로마토그래피 컬럼(Chromatography column) 내 고정상을 통과해서 흐르며 이때 다른 두 성질의 물질을 분리합니다. 여러 종류의 크로마토그래피 분리 기법이 있는데, 이는 분리하고자 하는 샘플의 특성에 따라 달라집니다. 이번 포스팅에서는 대표적인 크로마토그래피 분리 기법에 대해 알아보겠습니다.

크로마토그래피 분리 기법

분리하고자 하는 샘플의 크기에 따라 적용하는 크로마토그래피 기법이 달라질 수 있으며, 분자량 5,000을 기준으로 사용할 수 있는 크로마토그래피 기법은 아래와 같습니다.

Normal Phase Chromatography
순상 크로마토그래피(Normal phase chromatography)에서 이동상은 non polar이고, 고정상은 polar입니다. 물질의 극성 차이를 통해 샘플을 분리하며, 가장 전통적인 크로마토그래피 기법의 하나입니다. 일반적으로 크로마토그래피 칼럼은 극성인 실리카로 채워져 있기 때문에 분자가 극성일 경우 실리카 칼럼에 결합하고, 비극성 분자는 고정상을 빠르게 통과할 것입니다. 

Reverse Phase Chromatography

역상 크로마토그래피(Reverse phase chromatography)에서 이동상은 polar이고 고정상은 non polar입니다. 가장 널리 사용되는 기법이며, 컬럼 내 실리카는 8 또는 18개의 탄소를 추가함으로써 비극성 처리가 되었습니다. 분자가 비극성일 경우 실리카 칼럼에 결합하고, 극성 분자는 고정상을 빠르게 통과할 것입니다. oxidation 또는 deamidation과 같은 변형을 거친 단백질 분석에 활용됩니다.

Ion Exchange Chromatography

이온 교환 크로마토그래피(Ion exchange chromatography)는 ionic compound의 분리와 측정을 위해 사용되는 중요한 분석 기술입니다. 이온 크로마토그래피 분리는 이온 및 극성 분석물, 용리액에 존재하는 이온 및 크로마토그래피 지지체에 고정된 이온 작용기간의 이온 상호 작용을 기반으로 합니다. 경쟁 이온 결합 (attraction)으로 인한 이온 교환 및 유사한 전하를 가진 분석물 이온과 크로마토그래피 지지체에 고정된 이온 사이의 반발로 인한 이온 배제는 이온 크로마토그래피 분리에 중요한 역할을 합니다. 이 기법은 분자 크기와 분자 특성이 다른 전하 분자인 펩타이드, 단백질, 핵산 및 생체 고분자 분리에 사용되는 중요한 기술 중 하나입니다.

Size Exclusion Chromatography

사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)는 분자를 크기에 따라 분리하는 기법으로, 겔은 특정 크기의 기공을 포함하는 구형 비드로 구성됩니다. 크기가 다른 분자가 매트릭스 내 기공에 포함되거나 제외될 때 분리가 발생하게 됩니다. 작은 분자는 기공으로 확산되어 컬럼을 통한 작은 분자의 흐름이 지연되는 반면, 큰 분자는 기공으로 들어가지 않고 컬럼의 허공용적에서 용출됩니다. 결과적으로 분자는 컬럼을 통과할 때 크기에 따라 분리되고 분자량이 큰 순서로 용출됩니다. 해당 기법은 주로 단백질 aggregation과 degradation을 확인하기 위해 사용됩니다.

Hydrophilic Interaction Chromatography

Hydrophilic interaction chromatography(HILIC)는 친수성 고정상과 친수성 수성 극성 유기 이동상에서의 머무름(retention)을 기준으로 높은 친수성 및 극성 화합물을 분리하는 데 사용되는 액체 크로마토그래피 기법입니다. HILIC에서는 가장 친수성이 높은 물질이 빨리 용출된다는점입니다. 이는 일반적인 역상 크로마토그래피에서 볼 수 있는 순서와 대조적입니다. HILIC는 역상 LC에서 머무름이 적은 친수성 화합물을 효과적으로 머무르게 하여, 머무름(retention)이 없어 분석하기 힘든 샘플에 적용됩니다.

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